Quatre méthodes pour réguler le pH dans les bioréacteurs

Maintenir le pH à des niveaux biologiquement sains est potentiellement l’outil le plus puissant du bioprocédé amont pour augmenter les titres de produit.

Maintenir le pH à des niveaux biologiquement sains est potentiellement l’outil le plus puissant du bioprocédé amont pour augmenter les titres de produit. Les bioréactions sont coûteuses et s’étendent sur de longues durées, ce qui rend essentiel de tirer le maximum de chaque série.

Les cellules de mammifères ne sont viables que dans des environnements dont le pH est compris entre 7,1 et 7,4. Or ces cellules produisent naturellement du dioxyde de carbone comme sous-produit de la respiration, ce qui fait baisser le pH. Les cellules disposent naturellement de mécanismes pour éliminer le dioxyde de carbone et éviter des accumulations toxiques, ainsi que de systèmes tampons pour maintenir leur pH à des niveaux sains. Les bioréacteurs doivent imiter ces fonctions pour que les cellules puissent prospérer.

Qu’est-ce qui influence le pH d’une culture ?

Au début d’une série en bioréacteur, le tampon du milieu de culture maintient le pH aux niveaux souhaités. Du dioxyde de carbone peut même être injecté par barbotage pour garder le pH bas. Mais pendant la phase de croissance exponentielle de la culture, les cellules produisent de grandes quantités de dioxyde de carbone comme déchet métabolique. Le tampon cède et le pH chute rapidement.

À ce moment-là, il faut relever le pH de la culture. Autrefois, on pompait une base dans le milieu de culture. Aujourd’hui, les installations de bioréacteurs plus récentes utilisent des macrospargers pour introduire de grosses bulles d’air ou d’azote. Ces bulles ne se dissolvent pas facilement ; elles entraînent donc le dioxyde de carbone hors de la culture et l’amènent dans l’espace de tête du bioréacteur, où il est évacué.

La littérature récente a examiné de près les moyens les plus efficaces de réguler le pH dans un bioréacteur. Nous classons ici quatre approches de régulation du pH, de la moins efficace à la plus efficace.

La moins efficace : maintenir la pCO2 constante

La pression partielle du dioxyde de carbone dissous (pCO2) dans une culture est un paramètre de procédé critique en raison de son effet sur le pH intracellulaire et extracellulaire. La pCO2 détermine le gradient de concentration par lequel le dioxyde de carbone intracellulaire (généré comme sous-produit de la croissance cellulaire) quitte les cellules et passe dans le milieu de culture. Si la pCO2 est trop élevée, le CO2 ne peut pas quitter les cellules ; le pH intracellulaire va donc baisser et les cellules mourront. Si la pCO2 est trop faible, les cellules perdent le CO2 trop rapidement, leur pH augmente et le milieu intracellulaire devient trop basique pour que les cellules soient viables.

La pCO2 influe sur le pH, mais les deux ne sont pas étroitement corrélés

Surtout dans la plage de pH tamponnée, la pCO2 et le pH ne sont pas directement corrélés. La pCO2 donne donc bien moins d’informations sur l’état de santé de la culture que la mesure du pH.

La raison principale est que, pour de petites variations du pH dans le domaine de viabilité des cellules (pH 7,1 – 7,4), le tampon bicarbonate du milieu (extracellulaire) agira sur la pCO2 selon le principe de Le Chatelier.

De plus, les cellules de mammifères produisent du lactate, en plus du dioxyde de carbone, comme sous-produit de la respiration. Le lactate et le CO2 rendent tous deux la culture plus acide, mais l’effet du lactate sur le pH n’est pas reflété dans la mesure de la pCO2.

Une fois que le tampon a cédé et que le pH commence à baisser sensiblement, la pCO2 et le pH sont beaucoup plus étroitement liés. Mais ce n’est toujours pas un bon moyen de surveiller et de réguler le pH — qui est la variable réellement déterminante pour augmenter les titres cellulaires.

Moins efficace : pomper une base dans la culture

Les cellules produisent de grandes quantités de dioxyde de carbone pendant la phase de croissance exponentielle, ce qui entraîne des baisses de pH importantes. Une solution simple consiste à pomper une base dans le bioréacteur, directement asservie aux capteurs de pH.

Cette méthode est la plus efficace dans :

- Les petits bioréacteurs, où les effets d’un mélange irrégulier et de la localisation du pH peuvent être négligeables.

- Les environnements à faible pCO2 et à faible pH, où les cellules génèrent du CO2qui se dissout rapidement, abaisse encore le pH et ne peut pas être éliminé par des gaz de barbotage.

- Les fermenteurs fermenteurs cultivant des cellules microbiennes, plus robustes que les cellules de mammifères. Elles supportent à la fois une agitation et un mélange accrus, et sont moins sensibles aux fluctuations de pH.

Pomper une base ne garantit pas un pH constant dans tout le bioréacteur

Pour obtenir un titre de produit élevé, le pH doit être constant dans tout le bioréacteur, ce qui exige un mélange minutieux. Sinon, il se forme des poches localisées de pH particulièrement élevé ou bas. Or le mélange engendre de la mousse et accroît la contrainte de cisaillement, deux facteurs qui nuisent à la viabilité cellulaire.

Ces problèmes s’aggravent à mesure que la taille du bioréacteur augmente, ce qui signifie que le pompage d’une base se prête tout simplement mal au changement d’échelle. Le temps de mélange et l’agitation doivent tous deux augmenter avec la taille du bioréacteur pour éviter d’aggraver la localisation, mais cela se fait au prix de davantage de mousse et de contrainte de cisaillement.

Le pompage d’une base augmente aussi l’osmolalité (soluté par kilogramme de milieu de culture) de la culture. Dans les bioréacteurs plus grands, cela peut réduire la viabilité cellulaire et le titre de produit.

Plus efficace : combiner le pompage d’une base et les gaz de barbotage

La méthode traditionnelle de régulation du pH consiste à pomper une base dans un bioréacteur aux premiers stades d’une culture cellulaire, puis à utiliser des gaz de barbotage pendant la phase de croissance exponentielle. La base est particulièrement utile juste après la rupture du tampon, et les gaz de barbotage assurent une régulation serrée, pour des rendements maximaux d’une culture.

Le pompage d’une base présente des inconvénients importants, et les gaz de barbotage des avantages importants

Les installations les plus récentes utilisent principalement des gaz de barbotage pour réguler le pH. La littérature récente s’est détournée des autres méthodes pour se concentrer sur l’optimisation de la boucle de régulation des gaz de barbotage à partir du retour d’information du pH et d’autres paramètres de procédé critiques — dont la pCO2.

La plus efficace : n’utiliser que des gaz de barbotage

Les gaz de barbotage peuvent réguler le pH plus étroitement que les autres méthodes présentées, principalement parce qu’ils peuvent réagir le plus vite aux changements des autres paramètres de procédé critiques. Le mélange de gaz de barbotage offre aussi la régulation la plus précise et la capacité de répondre à la plus grande quantité d’informations provenant des divers capteurs du bioréacteur.

Plus précisément, plusieurs facteurs font de cette méthode la plus efficace :

- Les débits de barbotage ne sont limités que par les débits maximaux des régulateurs de débit massique qui alimentent les spargers en gaz. Les micro- et macrospargers spécifiques peuvent être conçus et dimensionnés en fonction des débits souhaités et des principes connus de transfert de masse.

- Les bulles de gaz issues des spargers peuvent être mélangées et réparties uniformément plus vite qu’une base, et avec bien moins d’agitation.

- Les gaz de barbotage se prêtent très bien au changement d’échelle, car le débit de barbotage et la taille des bulles n’ont souvent pas besoin de changer quand le bioréacteur change d’échelle. Une étude de 2018 de Hoshan et al. a maintenu le débit de barbotage constant et s’est contentée d’augmenter l’aération de l’espace de tête pour compenser l’augmentation de la taille du bioréacteur. Elle a observé des titres augmentés dans des proportions similaires dans des bioréacteurs de 30 L comme de 250 L, simplement en mettant en place des boucles de régulation plus optimisées entre le pH et l’air de barbotage.

La conception intelligente des spargers et de la boucle de régulation est essentielle

Si les gaz arrivent trop vite, ils introduisent une contrainte de cisaillement. S’ils arrivent trop lentement, les cellules ne se reproduiront pas aussi vite qu’elles le pourraient et n’atteindront pas le rendement maximal.

Des spargers bien conçus, en revanche, se prêteront bien au changement d’échelle et produiront des titres constamment élevés.

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